综上所述，每种方法也都有各自的优势与缺点，每种定量方法仅能检测某些理化滴度指标或某一生物学滴度，一种方法无法检测所有滴度指标；且都要在检测通量和分辨率之间进行权衡取舍。
准确的滴度测定是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分，也是开展临床前研究和临床研究的前提，稳定可靠的滴度才可能正真的保证准确给药剂量，更好地指导临床用药。根据AAV滴度测定不同原理，可以将其分为物理滴度测定和生物学滴度测定两大类，物理滴度包括病毒颗粒滴度（或衣壳滴度）和基因组滴度；生物学滴度包括感染滴度和转导滴度等。
病毒颗粒滴度又称为衣壳滴度，是以AAV颗粒数作为计量单位，测定的是AAV颗粒浓度，可分为实心AAV颗粒滴度、空心AAV颗粒滴度和AAV颗粒总滴度等。AAV工艺中较高的空壳率一直是AAV工艺面临的主要挑战之一，野生型AAV的空壳率一般在50%以上，AAV工艺采用的基因组序列缺失了部分包装相关的顺式元件，其空壳率相对更高。目前监测病毒颗粒滴度或颗粒滴度比值的方法较多，例如酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA）、透射电镜（Transmissionelectron microscopes, TEM）、高效液相色谱（High-performanceliquid chromatography, HPLC）、分析型超速离心技术（AnalyticalUltraCentrifugation,AUC）等，其中TEM与AUC一般只用来检测AAV制品中空壳AAV颗粒滴度与实心AAV颗粒滴度的比值【1,2】。
ELISA通过与AAV衣壳特异性结合抗体上连接的酶催化底物反应显色来测定AAV颗粒滴度。最常见的为抗体夹心ELISA法，先将捕获抗体固定在ELISA板上，用于特异性结合AAV颗粒，然后被捕获的AAV颗粒通过和检测抗体结合并加入底物实现酶促显色反应进行定量。目前基于ELISA法的针对多种血清型抗原表位的特异性单克隆抗体已经实现商业化应用。该方法通常用于纯化后的AAV，优点是重现性和特异性较好，但操作步骤较为繁琐，实验周期一般较长。鉴于上述缺点，研发人员将其转移到成熟的Gyrolab系统（GyrosProtein Technologies. Gyrolab ImmunoassaySystems®.2020.），开发了一种基于自动化微流体平台的小型化ELISA，有望缩短实验周期并将检测通量提高到每小时96个样本，同时将线性范围提高一个数量级。此外，无法区分完整的实心AAV颗粒与空壳颗粒是ELISA法的一大遗憾。
AAV颗粒直径约为20~26nm，可通过透射电镜较为直观的观察其外观，通过直接计数来定量AAV颗粒，但是用于电子显微技术的样品制备易产生伪影，一般不用来计算绝对滴度。但在检测病毒空壳含量与实心病毒颗粒含量比值方面，这种方法较为经典。相对包装了基因组的AAV颗粒，由于未包装了基因组DNA的病毒颗粒中间密度低，在电镜下颗粒图像中部会出现空洞（黑点），而含基因组病毒颗粒为实心。但偶尔由于样本染色操作的流程的差异，可能会引起一定误判，此外，一部分AAV包装进去的基因组不完整，介于空壳颗粒与实心颗粒之间，也为准确定量实心颗粒滴度带来一定困难。尽管有报道TEM可用于未纯化的样品，但它通常被用于纯化样品，因为细胞裂解物中存在的蛋白质和细胞碎片等杂质会干扰对TEM图像中AAV衣壳的准确识别【3】。
HPLC是一种快速方便的分析技术，以液体作为其流动相，采用高压注液系统，将具有不一样极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行仔细的检测，在化学产品定量分析中很常见，也可用于定量分析AAV，能够区分AAV制品中空衣壳和完整衣壳的含量，且可应用于各种血清型AAV定量检测，检测通量高，可应用于AAV工艺中即时检测。尺寸排阻色谱与18角度激光光散射检测器联用技术（SEC-MALS）目前已被比较广泛的应用于生物制品的工艺过程中，是一种功能强大的分析工具。一次进样，15-30min即可精确定量AAV制品的多个关键质量属性指标：滴度、总蛋白浓度（Cp）、纯度/聚集体比例等【1,4】与传统方法相比，具有高效、快速、准确度高等优点。
AUC技术主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检验测试手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。通过紫外线吸收或者Raleigh干扰，实时扫描检测离心过程中样本中各个组分跟着时间其沉降剖面分布状态的变化过程，计算出各个组分的沉降系数。根据空壳AAV和实心AAV沉降系数差异，可准确定量空壳AAV滴度和含完整基因组的实心AAV滴度的比值。
AUC在定量不同颗粒滴度比方面具有重复性高（变异系数仅为2%）且能够有效区分完整衣壳与空衣壳颗粒。AUC分析法的缺点是只能检测纯化的AAV制品，且检测样品用量较大。此外AUC检验测试周期较长，约为6小时，一次仅能分析3~7个样本，实验通量低。
上述几种检测AAV颗粒滴度或不同颗粒滴度比值的方法，在准确度、灵敏性及实验周期等方面各有优缺点，往往需要多种方法互相辅助、相互印证。
基因组滴度以AAV衣壳中所含基因组含量作为定量依据，测定的是含目标基因组的AAV浓度。AAV中包含的基因组是其表达蛋白或RNA的前提，是AAV药物发挥药效的核心或基础，若AAV中不含基因组，药物不仅没有药效，反而会增加机体针对AAV药物的免疫反应。基因组滴度理论上应该与生物学滴度（感染滴度或转导滴度）呈线性关系。
基因组滴度测定目前有PCR法、点杂交法（Dot-blot）和分光光度法等。无论哪种方法，第一步是要将AAV颗粒外部的DNA成分用DNaseI彻底消化去除，否则会影响定量准确性，使基因组滴度测定偏高。
点杂交法是一种较为早期的定量方法，将靶标DNA吸附结合到硝酸纤维膜或尼龙膜上，后采用标记的特异性探针与AAV基因组DNA片段杂交结合，之后通过荧光或显色的方式定量AAV基因组滴度。由于杂交溶液中一些成分会干扰基因组DNA与硝酸纤维膜或尼龙膜结合等因素，导致其实验的差异性较高，加之其操作繁琐，试剂昂贵等因素，逐步被目前其它检测的新方法取代。
PCR法因为简单易操作、重复性好和经济等因素是目前检测AAV基因组滴度最广泛的方法。PCR法目前常用的包括qPCR法和微滴式数字PCR法（ddPCR），qPCR作为第二代PCR方法，目前是各个研究机构及其药企采用最广泛的AAV基因组滴度定量方法。而微滴式数字PCR（ddPCR）被称为第三代PCR技术，作为一种新兴技术与旧的PCR技术（例如qPCR）相比，可针对核酸分子做更精确的定量分析【5】。微滴式数字PCR的创新之处在于标准PCR反应体系经过微滴发生，将目标分子稀释到多个微滴中，每个微滴大体上只包含一个或不包含目标DNA模板，实现”单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有目标分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。因此，无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量。
相对于传统的qPCR方法，ddPCR在定量准确性、灵敏度及稳定性方面具有显着优势。更准确可靠的病毒载体滴度对毒理学及临床相关的给药剂量范围研究至关重要。若滴度定量虚高，则实际药效可能太低，可能无疗效；若滴度定量虚低，则可能会引起严重的副作用，例如细胞因子风暴。
与qPCR相比，ddPCR不需要依赖多个扩增循环来确定每个样品中相对于标准曲线的核酸含量，即ddPCR允许对样品中存在的目标核酸分子进行绝对而非相对标曲的“相对”定量及相对内参的相对定量。qPCR结果的准确性、精确度与实验中使用的标准曲线直接相关，目标分子定量结果的准确性将取决于标准曲线的优化情况。在标曲样本与目标样本间扩增的差异（例如，标曲DNA的高级结构与待测目标DNA分子的高级结构有几率存在明显差异）可能会引起针对目标DNA定量的明显误差，因为不同结构的DNA（环形、超螺旋、线性；单链、双链；不同碱基序列引起的高级结构等）具有不一样的扩增效率。因此，使用未优化的标准曲线将导致绝对定量结果不准确，这可能是不同实验室间qPCR定量结果存在非常明显差异的重要来源【6】。有研究表明：qPCR定量对DNA标准品中二级结构的抑制作用敏感，这可能会引起高估的病毒滴度，而ddPCR定量目标分子，其最终定量结果不受DNA二级结构影响，如下图所示。综上所述，相对qPCR，无需标准曲线是ddPCR定量结果准确性和稳定能力相对更高的原因之一。
在多数PCR基础的反应中往往会存在多种化学特性的抑制剂，这些成分存在于样品中，可能与DNA共纯化获得且难以去除。由于ddPCR对影响PCR扩增效率的污染物的敏感性较低，这进一步提升了ddPCR准确性和灵敏度。而qPCR技术定量原理是需测样品与标准品之间Ct值的相对定量，若需测样本或标准品中存在抑制物，则PCR效应将受影响，可能会引起依赖标准曲线定量的结果不准确，若样品中的PCR抑制物抑制效应明显，则会明显降低qPCR灵敏度。
以AAV滴度检测为例，AAV滴度检测一般要对基因组进行抽提操作，且在定量其滴度前，需要用DNA酶I对其进行消化处理，以降低游离DNA对AAV定量的影响。另外，若是AAV粗品，则其中会含有大量的核酸、杂质蛋白等生物大分子，因此，无论是AAV纯品还是粗纯产品，其样本PCR反应体系中都会含有相对多的酶、衣壳蛋白或其它杂质蛋白等抑制PCR反应的成分，这些成分会干扰qPCR准确定量，可能会引起qPCR定量的AAV滴度批间或批内差异大，不能非常容易满足基因治疗产品批内/批间稳定性要求。AAV定量急需一种定量误差小、准确且稳定性高的方法，据调研，微滴式数字PCR技术在这方面有着非常明显优势，且已受到慢慢的变多业内人士的青睐。
有研究表明，ddPCR技术定量下游纯化过程中的AAV样本，无论是DNA酶处理组，DNA酶和蛋白酶K处理组，其结果CV值均小于qPCR检验测试的数据，说明ddPCR检测AAV样本的稳定性高于qPCR技术【7】。
有研究报道，在qPCR和ddPCR技术方法的直接比较中，针对单链AAV载体基因组的绝对定量，dPCR的灵敏度是qPCR的四倍【8】。
分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，测量260nm和280nm处核酸和蛋白的光吸收来定量AAV基因组滴度和衣壳滴度，操作简单便捷。从方法学上它常常可当作一个检测器，整合到高效液相色谱技术（HPLC）或分析型超速离心技术（AUC）中，详见上面HPLC方法和AUC方法部分。
测定AAV感染滴度的目的是确定其基因组是否转移到细胞核并进行复制，AAV基因组转移至细胞核是其成功表达基因治疗产物的前提，感染滴度与AAV入胞后的转基因表达效率无显著关系，因此，不受转基因表达效率的干扰，有利于含不同基因表达框的AAV制品间的比较。AAV感染不会导致细胞病变效应，因此，空斑实验（plaqueassays）不能用于确定其感染滴度；但是，在辅助病毒存在的情况下，可以诱导AAV基因组的复制，通过PCR检测或探针杂交法可进行感染滴度检测。
目前普遍的使用的感染滴度测定方法之一是TCID50法，该方法一般利用腺病毒作为辅助病毒，在辅助病毒存在情况下，AAV经10倍倍比稀释后于96孔板中感染AAV-rep和cap表达细胞系，之后通过PCR检验测试判定阴性与阳性孔数量，采用组织培养半数感染剂量公式—Spearman-Karber公式来计算感染滴度（Alt,Nadja, et al. Biologicals 44.5 (2016): 291-305.）。
目前AAV采用TCID50法面临的挑战是精密度差，变异系数大，多数文献发表的TCID50感染滴度结果%CV值＞70%【9,10】，其中辅助病毒的稳定性、细胞类型、细胞数量、PCR引物体系、实验人员的操作等众多因素都会影响其定量数据，因此，对实验环境、实验参数控制等要求比较高。由于对实验环境、实验操作参数等要求严格，目前国内大多数AAV基因治疗研发企业不具备AAVTCID50感染滴度检验测试能力，往往选择检测外包。目前，国内专业的针对AAV载体服务的CRO&CDMO企业，例如宜明细胞等具备上述检测技术平台，已服务了多个成功提交IND申报或研究者发起的临床试验研究用的临床级别的AAV产品的批放行检测。
RCA法（Replicationcenterassay）是较早期的一种检测的新方法，以腺病毒作为辅助病毒，同时需要野生型AAV（wtAAV）来提供AAV-rep和cap，AAV感染细胞24~48h后，细胞被转移到膜上，通过与与标记探针杂交来检测感染中心（代表单个感染的细胞），阳性信号表明AAV成功入胞、脱壳，且具有复制能力，如上所述，该方法无法检测目的基因能否成功表达。
感染中心检测法(infectious center assay，ICA)可以认为是RCA法的改进版，采用AAV-rep和cap稳转细胞系作为AAV感染细胞，无需wtAAV共感染，避免或减少了实验环境中wtAAV污染。此外，还能够使用复制缺陷型单纯疱疹病毒（HSV）来替代腺病毒和wtAAV提供给RCA法所需的所有辅助元件，无需辅助性病毒，逐步降低了复制型病毒的污染风险【11,12】。
转导滴度是将AAV经梯度稀释后，感染实验细胞，通过检验测试目的基因（或转基因）的表达情况来判定是否阳性，根据阳性细胞数量或阳性孔数量，结合病毒稀释度来计算转导滴度，其计量单位为转导单位（Transductionunit,TU)。实际操作的流程中，提高检测灵敏度，往往采用辅助病毒共感染的方式来提高AAV转基因的表达率，其计量单位为增强的转导单位（Enhancedtransduction unit，ETU）。
目前，转导滴度的测定一般都会采用细胞株体外实验方式来进行仔细的检测，而非采用AAV基因治疗药物的靶细胞。转基因表达效率与细胞类型有一定的关系，因此，能采用靶细胞或与其相近的细胞类型，检测出的转导滴度对临床前实验或临床试验才具备比较好的指导意义。
综上所述，每种方法也都有各自的优势与缺点，每种定量方法仅能检测某些理化滴度指标或某一生物学滴度，一种方法无法检测所有滴度指标；且都要在检测通量和分辨率之间进行权衡取舍。
此外，除了AAV制品滴度外，AAV制品的纯度、稳定性、病毒颗粒聚集情况等指标的表征也是AAV基因治疗药物质量控制的重要组成部分，准确快速的表征对于工艺开发与临床申报意义重大。与传统小分子和大分子药物相比，全面准确表征AAV药物更具挑战性。
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