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GPC绝对分子量测试多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪 联接与应用技MALLSGPC(SEC)

时间: 2024-04-08 23:52:49 |   作者: 竞技宝测速站dota2

  近十几年来,光散射技术(Light scattering)在高分子特征分析领域的应用得到 了迅速的发展。将光散射技术和凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography, GPC) 或尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography)分离技术相结合,不仅能测得 大分子的绝对分子量,分子旋转半径与第二维里系数,还可测得分子量分布,分辨分 子量大小不同的族群以及分子的形状,分枝率及聚集态等。目前,该技术已成为一种 很有效的工具,在美国,日本及欧洲已广为使用,国内近年来亦引进了此项技术。

  早在十九世纪初,人们就开始对光散射原理进行研究。自六十年代激光被发明以来, 光散射的原理与技术便得以迅速发展,至今已成为检测微小粒子形状,粒径大小,分 子量,界面电位及粒子间效应的重要工具。随着电脑技术的日新月异,许多过去需花 费数小时甚至数日才能完成的实验,如今只需数分钟就可以完成,而其准确性及重现性 也大幅度提升了。 光散射现象,如图 1 所示,当一束光通过一间充满烟雾的房间就会产生散射。利用 在不同角度,不同时间所测得的光散射强度,再借助各种光学理论及软件,硬件设备, 就可以测得微粒的许多特性。

  研究了远小于波长的微粒散射现象,发现了散射强度与波长的四次方成反比,并解 释了蓝天被太阳光穿透大气层所产生的散射现象。

  印度籍物理大师,提出了 Raman 效应,其著作多次发表于印度文期刊,直至第二次 世界大战结束后才逐渐被人所知。

  延续了 Einstein 的理论,描述了分子溶解于溶剂中所产生的光散射现象,提出用 Debye plot, 求得重量平均分子量 Mw。

  激光照射到样品时,会在各个方向产生散射光,于是我们大家可以在一个角度或多个角 度收集散射光的强度。

  在任何方向的光散射强度与分子量和溶液的浓度成正比; 散射光角度的变化与分子 的尺寸大小有关。当分子小于 10nm 时,各个角度的散射强度都相同; 当分子介于 10 至 30nm 时,散射强度则由低角度向高角度呈直线下降的趋势; 而当分子大于 30nm 时,散射强度则随角度增大呈曲线. 基本理论

  由 Maxwell,Einstein,Debye 及 Zimm 等人陆续发展起来,有关溶剂中分子量的 光散射现象可由下列公式表达:

  A2值,这是极少数能直接测得绝对分子量的方法之一。但由于结果仅为单一平均值,因此较适用于成分单一,分布较窄的分子,对于分布较宽或有不同族群分

  GPC/SEC 可以将溶剂中的分子按重量或尺寸大小依次洗脱出来。利用此项技术将光

  通常 GPC/SEC 的样品注射浓度就很低,再经过色谱柱得到进一步的稀释,图 4 中

  不论是分布较宽或是多峰分布的样品,皆可经过测量分子量及分子旋转半径得到分

  量,无法测得旋转半径,所以最起码要加上一组高角度来修正,则误差会较少很多。

  MALLS 利用色谱柱分离出的样品在各个角度的光散射量(如图 13),由 RI 检测器 得到的洗脱液浓度及 dn/dc 值,即可计算出各个切片的分子量。MALLS 测得绝对分子量 所需的各种物性均可由实验直接求得,无需作任何假设。而 GPC 的色谱柱又有分离杂 质的功能,能够尽可能的防止传统的光散射需极小心准备样品的麻烦。图 14 显示高分子混合物 经 SEC 分离后 MALLS 及 RI 的洗脱体积对照图。由此图看出 RI 对大分子量浓度低的物 质较不敏感,而对低分子量高浓度者较敏感。

  以往,在水相中用低角度光散射测量法(LALLS)受到溶剂中不纯的物质干扰相当

  大。而 MALLS 的多角度测量大幅度的降低了背景噪音的干扰,并能提供完整的信息和良好

  MALLS 还能够适用于如抗原,抗体等反应迅速的溶液系统,粒子和蛋白质聚集现象的检测。因为 MALLS 内部同时装有数个固定的检测器,所以不需移动任何仪器硬件来扫描样品,即可及时多方位同时捕捉反应速率的现象。使用 MALLS,可研究抗原-抗体反应,反应发生时就可决定聚集粒子的大小。当改变温度,浓度或催化剂时,MALLS 可记录下反应发生时,分子的特殊变化。

  使用 DAWN 检测器研究了浓度对分子量为 75KD 单分子蛋白质聚集作用的影响。图 19 描述了这种特殊蛋白质从 30ug/ml 到 1mg/ml 范围内得到的浓度相关性。如图所示, 该蛋白质在低浓度作为单一分子而在浓度大于 700ug/ml 时聚集为六聚体。该结果与gluteraldehyde 高度交联技术所得结合完全相符。

  传统的光散射法只能确定平均分子量,旋转半径及第二维里系数,而 GPC/SEC 又 受泵流速的限制,再加上寻找与待测物结构相似的标准品不易,对低浓度高分子量的部分,如 microgel, trimer, dimer 等信号不敏感,导致误差增大,色谱柱容易老化。 而多角度激光光散射仪(MALLS)与 GPC/SEC 结合,正可以互相补充,不仅能直接测得绝对分子量,还可以对样品的组成,从低浓度高分子量到高浓度低分子量,都能解析的很清楚,更能够获得许多有用的信息,如分子的形状,分枝状况,聚集态及动力学参数,反应速率等,其功能与应用普及性正与日俱增。

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