脊髓是中枢神经体系的重要组成部分，承担着神经信号传导和神经调理等要害功用。在脊髓损害、神经退行性疾病（如多发性硬化症等）中，脊髓内的细胞结构和功用会产生明显改动。但是，因为脊髓的特别生理方位和杂乱的安排架构，对其进行活体状况下的研讨面对许多应战，传统的研讨办法（如安排切片等）难以捕捉到脊髓内细胞的动态改动进程。跟着光学成像技能的渐渐的提高，如双光子荧光成像（TPEF）、受激拉曼散射成像（SRS）等技能的出现为在体调查生物安排内部结构和细胞动态供给了或许。一起，基因修改技能的开展使得能够终究靠构建转基因动物，对特定细胞类型进行荧光符号，逐渐推动了活体成像研讨的开展。但如何将这些技能有用使用于脊髓研讨以处理上述说到的问题，仍要一向探究和优化试验办法。
选用Thy1-YFP-H×CX3CR1GFP/+双转基因小鼠，Thy1-YFP-H使有髓轴突特异性表达黄色荧光蛋白（YFP），CX3CR1GFP/+让小胶质细胞特异性表达绿色荧光蛋白（GFP），完成两类细胞在活体脊髓中双色可视化，为调查二者互作供给根底。
麻醉小鼠，剃除手术区域（T11-T13椎骨对应背部）毛发，用碘伏消毒皮肤，树立无菌操作环境。该进程保证手术区域清洁，防止感染搅扰后续成像及细胞状况。
在T11-T13椎骨上方做小切断，逐层别离露出椎骨；移除椎骨外表及两边肌肉、肌腱，用定制安稳台的夹持杆固定椎骨，坚持脊髓成像区域安稳。
要害：保存黄韧带（LF）完好，它是坚持脊髓部分微环境、防止手术引发免疫激活（如小胶质细胞反常形状改动）的中心结构。
轻柔整理T12-T13椎空隙内残留肌肉/肌腱，露出被黄韧带掩盖的脊髓；手术全程防止触碰脊髓及窗口外表，防止物理损害。向脊髓与盖玻片（置于夹持杆）的0.5-1mm空隙注入碘克沙醇，使用其光学通明特性消除安排散射，为双光子/受激拉曼成像供给明晰光路。
成像前，经小鼠眶后静脉注射50μl德克萨斯红葡聚糖（70kDa，1mg/100μl生理盐水）使微血管被荧光符号，拓宽成像调查维度。
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选用双光子荧光（TPEF）+受激拉曼散射（SRS）成像体系：TPEF用于捕捉YFP（轴突）、GFP（小胶质细胞）荧光信号；SRS使用髓鞘拉曼峰（2863.5cm⁻¹）精准定位朗飞氏结（NR），穿插验证成像区域。
优势：多模态成像结合，既看细胞动态（TPEF）又精准锚定结构（SRS），处理生理互作研讨需精准定位轴突功用区的难题。
按时刻序列（0-3分钟等距离）收集荧光图画，记载小胶质细胞突起（初级/次级）与轴突（含NR）的触摸、脱离进程，获取细胞互作动态数据。
操作关键：坚持成像参数安稳（激光功率、扫描速度等），削减人为差错；设置合理时刻距离（如分钟级），平衡“捕捉动态”与“防止光损害”。
人工/半自动标示图画中“小胶质细胞-轴突触摸事情”，区别间歇性触摸（小胶质细胞突起时刻短附着后脱离）与继续性触摸（触摸继续数分钟至数小时）。
计算不同触摸形式占比，相关小胶质细胞结构（次级突起主导间歇性触摸，初级突起/胞体参加继续性触摸），解析结构-功用相关。
以“单个朗飞氏结（NR）”为单位，制作时刻轴（横轴，分钟）×触摸状况（纵轴，有/无触摸）的矩阵图，计算有触摸的NR占比随时刻改动曲线。
移除碘克沙醇，用生理盐水冲刷；涂改液态Kwik-Sil固化维护窗口，缝合皮肤并涂聚维酮碘防备感染；小鼠置于加热垫复苏，独自养殖。
再次成像时，剪开皮肤、移除固化Kwik-Sil；剥离椎骨重生安排，保证夹持安稳；整理肉芽安排、从头露出黄韧带，重复光学通明-成像流程，完成长时间活体追寻。
立异点：在“保存黄韧带、防止免疫激活”的前提下，完成脊髓内小胶质细胞-轴突（朗飞氏结）动态互作的活体可视化，处理传统办法（如固定安排切片）无法捕捉生理状况下细胞实时行为的痛点。 使用场景：为研讨“神经-胶质互作的生理机制、损害后呼应形式”供给要害技能，后续可拓宽至脊髓损害、神经退行性疾病模型，解析小胶质细胞的维护/损害作用机制。
在构建光学通明椎间窗口或其他露出脊髓的操作中，简单对脊髓安排形成物理损害，如穿刺、揉捏等，从而影响脊髓的正常功用和成像成果。此外，去除椎骨周围肌肉和肌腱等安排时，若操作不妥或许损坏脊髓的血供，导致部分缺血缺氧，影响细胞活性；
为了完成长时间、屡次的活体成像，需求保证窗口的安稳性。但在试验进程中，窗口资料（如盖玻片等）或许会产生移位、污染，影响成像质量；并且窗口与脊髓安排之间的光学介质（如碘克沙醇）若丢失或蜕变，也会下降光学通明度，搅扰成像作用。
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